Irányított evolúció
Az irányított evolúció (DE) egy olyan módszer, amelyet ipari vagy orvosi célú enzimek előállítására használnak.
A módszer a fehérjemérnökség, amely a természetes szelekciót utánozza.
Az alapötlet az, hogy egy gént ismételt mutációs köröknek vetnek alá, hogy egy variánskönyvtárat hozzanak létre. A szelekció izolálja a kívánt funkcióval rendelkező géneket. Ezek képezik a következő forduló sablonját.
Ez történhet in vivo (élő baktérium- vagy élesztősejtekben) vagy in vitro (szabad oldatban vagy mikrocseppekben).
Több mutáns tesztelése növeli annak az esélyét, hogy találunk egyet a kívánt tulajdonságokkal.
Az in vivo evolúció során minden egyes sejtet (általában baktériumot vagy élesztőt) a variánskönyvtár egy-egy különböző tagját tartalmazó plazmiddal transzformálnak. A sejtek között csak a kívánt gén különbözik, az összes többi gén változatlan marad.
A sejtek a fehérjét vagy a citoplazmájukban vagy a felszínükön expresszálják, ahol a fehérje működése vizsgálható. Ennek a formátumnak megvan az az előnye, hogy a tulajdonságokat sejtkörnyezetben szelektálja, ami akkor hasznos, ha a kifejlesztett fehérjét vagy RNS-t élő szervezetekben kívánják felhasználni.
A sejtek nélkül végzett DE in vitro transzkripciós transzlációval állít elő fehérjéket vagy RNS-t szabadon, oldatban vagy mesterséges mikrocseppekben. Ennek az az előnye, hogy több körülményt (pl. hőmérséklet, oldószerek) tesz lehetővé. Olyan fehérjéket is kifejezhet, amelyek a sejtek számára mérgezőek lennének. Továbbá az in vitro evolúciós kísérletek sokkal nagyobb (akár 1015) könyvtárakat is létrehozhatnak, mivel a könyvtár DNS-ét nem kell a sejtekbe beilleszteni. Ez gyakran korlátozza az elvégzendő feladatokat.
Az irányított evolúció példája a természetes evolúcióval összehasonlítva. A belső ciklus az irányított evolúciós ciklus három szakaszát mutatja, zárójelben az utánzott természetes folyamat. A külső kör egy tipikus kísérlet lépéseit mutatja. A piros szimbólumok funkcionális változatokat, a halvány szimbólumok csökkentett funkciójú változatokat jelölnek.
Az öröklődés biztosítása
Ha funkcionális fehérjéket izoláltak, akkor szükséges, hogy génjeik is azok legyenek, ezért genotípus-fenotípus kapcsolatra van szükség.
Ez lehet kovalens, amikor az mRNS-gén a transzláció végén puromicinnel kapcsolódik a fehérjéhez.
Alternatívaként a fehérje és a génje együtt vagy emulziós cseppekben is tartható. Az izolált génszekvenciákat ezután PCR-rel vagy transzformált gazdabaktériumokkal szaporítják. Vagy az egyetlen legjobb szekvencia, vagy a szekvenciák egy csoportja használható templátként a következő mutagenezishez. A diverzifikáció-szelekció-amplifikáció ismétlődő ciklusai a szelekciós folyamathoz igazított enzimvariációkat eredményeznek.
A kifejezett fehérje kovalensen kapcsolódhat a génjéhez (mint az mRNS) (balra), vagy a génnel egy rekeszbe kerülhet (jobbra). A fehérjét kódoló gént mindkét esetben izoláljuk.
Megítélt díj
Frances Arnold amerikai mérnök kapta a Millenniumi Technológiai Díjat az irányított evolúció úttörő munkájáért.
Kérdések és válaszok
K: Mi az irányított fejlődés?
V: Az irányított evolúció (DE) egy olyan módszer, amelyet ipari vagy orvosi célú enzimek előállítására használnak. Ez a fehérjemérnökség egy formája, amely a természetes szelekciót utánozza.
K: Hogyan működik az irányított evolúció?
V: Az irányított evolúció úgy működik, hogy egy gént ismételt mutációs köröknek vetnek alá, így létrehozva egy variánskönyvtárat. A szelekció ezután izolálja a kívánt funkcióval rendelkező géneket, amelyeket aztán sablonként használnak a következő fordulóhoz.
K: Hol lehet irányított evolúciót végezni?
V: Irányított evolúciót lehet in vivo (élő baktérium- vagy élesztősejtekben) vagy in vitro (szabad oldatban vagy mikrocseppekben) végezni.
K: Milyen előnyei vannak az in vivo irányított evolúciónak?
V: Az irányított evolúció in vivo végrehajtásának előnye, hogy a tulajdonságokat sejtkörnyezetben szelektáljuk, ami akkor hasznos, ha a kifejlesztett fehérjét vagy RNS-t élő szervezetekben kívánjuk felhasználni.
K: Milyen előnyei vannak az in vitro irányított evolúciónak?
V: Az in vitro irányított evolúció előnye, hogy több körülményt (pl. hőmérséklet, oldószerek) tesz lehetővé, és olyan fehérjéket is kifejezhetünk, amelyek a sejtekre mérgezőek lennének. Továbbá sokkal nagyobb könyvtárakat lehet létrehozni, mivel a DNS-t nem kell a sejtekbe beilleszteni.
K: Mi korlátozza az in vitro kísérlet során végezhető műveleteket?
V: Az in vitro kísérlet során végezhető műveletek méretbeli korlátját gyakran az határozza meg, hogy mennyi DNS-t kell a sejtekbe beilleszteni.
