Transzformáció (molekuláris biológia): DNS-felvétel és transzfekció
Transzformáció (molekuláris biológia): Ismerd meg a DNS-felvétel és transzfekció módszereit, kompetens baktériumokat és alkalmazásokat kutatásban és biotechnológiában.
A molekuláris biológiában a transzformáció egy sejt genetikai megváltoztatása a DNS közvetlen felvételével és kifejeződésével a környezetéből. A folyamat lehet természetes vagy mesterséges. A transzformáció során a bejutott DNS maradék genomiális integráció formájában beépülhet a gazdasejt genomjába, vagy önállóan replikálódó elemként (plazmidként) maradhat a sejten belül.
A transzformáció egyes baktériumfajokban természetes módon is előfordul, és mesterségesen is elvégezhető. Azokat a baktériumokat, amelyek természetes vagy mesterséges úton képesek átalakulni, kompetensnek nevezzük. A kompetencia lehet állandó (egyes fajoknál) vagy indukálható külső tényezők hatására (táplálkozási hiány, sejtciklus-szabályozás stb.).
Módszerek: természetes és mesterséges transzformáció
Természetes kompetencia esetén a baktériumok speciális fehérjekomplexeket (pl. típus IV pili rendszerek) használnak a környezetükben lévő szabad DNS felismerésére és felvételére. Tipikus természetes kompetens baktériumok például bizonyos Streptococcus, Bacillus, Neisseria, Haemophilus és Acinetobacter fajok.
Mesterséges transzformációra több elterjedt laboratóriumi módszer létezik:
- Kémiai kompetencia és hő‑sokk (pl. CaCl2): a sejtek membránpermeabilitását növelik, majd rövid, kontrollált hőmérséklet‑ugrás (heat shock) segíti a DNS bejutását.
- Elektroporáció: rövid, nagyfeszültségű elektromos impulzus hoz létre átmeneti membránpórusokat, amelyeken a DNS bejuthat. Nagyon hatékony nagy mennyiségű és nagyobb méretű DNS esetén.
- Fizikai és kémiai transzferek eukarióta sejtekbe: lipidek (lipofekció), kalcium‑foszfát, polietilén‑imin (PEI) és egyéb kémiai reagensek segítik a DNS/ RNS bejutását eukarióta sejtekbe.
Transzfekció — eukarióta sejtekbe történő bevitel
Az idegen DNS eukarióta sejtekbe történő bevitelét általában "transzfekciónak" nevezik. A transzfekciós módszerek eltérnek a baktériumos transzformációtól: tipikus technikák a lipofekció, elektroporáció, kalcium‑foszfát ülepítés és virális vektorok alkalmazása (adeno‑, lentivírusok stb.). A transzfekció célja lehet ideiglenes kifejezés (transzient) vagy stabil génintegráció (stable), amelyhez gyakran kromoszóma‑integrációt vagy szelekciós markerrel történő klónozást alkalmaznak.
Gyakorlati protokoll (egyszerű áttekintés baktériumokra)
Általános lépések laboratóriumi transzformációnál:
- Kompetens sejtek előállítása (kémiai kezelés vagy elektromos komptencia létrehozása).
- A DNS (plazmid) és a kompetens sejtek összekeverése rövid inkubációval.
- Bejuttatást segítő lépés: hő‑sokk vagy elektropulzus.
- „Recovery” fázis: a sejtek tápoldatban regenerálódnak, kifejeződik a szelekciós marker.
- Szelektív táptalajra terítés (pl. antibiotikumot tartalmazó agar), majd kolónia‑számlálás és ellenőrzés (pl. kolóniapCR, plazmidizolálás és restrictáz‑emésztés vagy szekvenálás).
Alkalmazások
A transzformáció és transzfekció alapvető módszerek a molekuláris biológiai és biotechnológiai munkában:
- Génklónozás és plazmidok sokszorosítása.
- Rekombináns fehérjék expressziója (enzimek, antitestek, gyógyszerfehérjék).
- Funkcionális genomikai vizsgálatok: gének túl‑ vagy alulexpressziója, reporter‑asszayok (pl. GFP, luciferáz).
- Sejt‑ és állatmodellek génmódosítása (transzgének előállítása, géncélzás).
- Gyógyszerfejlesztés, vakcina‑ és terápiás vektorok előkészítése.
Működés, genetikai sors és korlátok
Mi történik a bejuttatott DNS‑szel? A lehetséges sorsok közé tartozik:
- Plazmidként marad a sejtben és replikálódik (ha rendelkezik replikációs eredettel).
- Integrálódik a kromoszóma egy beépülési (rekombinációs) esemény során, gyakran RecA által közvetített homolog rekombináció révén.
- Elszaporodás nélkül degradálódik nukleázok hatására.
Természetes jelentőség és biosafety
A természetes transzformáció fontos szerepet játszik a horizontális génátvitelben, amely hozzájárul a baktériumok evolúciójához és az antibiotikum‑rezisztencia terjedéséhez. Emiatt a laboratóriumi munkában szigorú biosafety előírások érvényesek: megfelelő szintű biológiai biztonsági kabinok, szelekciós markerek körültekintő használata, és az antibiotikum‑rezisztencia gének felelős alkalmazása.
Összefoglalás
A transzformáció a sejt genetikai anyagának megváltoztatására szolgáló központi eszköz mind a kutatásban, mind az ipari biotechnológiában. Baktériumokban lehet természetes és mesterséges, míg eukarióta sejtekbe történő DNS‑bevitelt általában transzfekciónak nevezzük. A módszerek és protokollok sokfélesége lehetővé teszi a célzott génmanipulációt, ugyanakkor a környezeti és biztonsági kockázatokat is figyelembe kell venni.
Történelem
A transzformációt először 1928-ban mutatta ki Frederick Griffith brit bakteriológus. Griffith fedezte fel, hogy a Streptococcus pneumoniae egy ártalmatlan törzsét virulenssé lehet tenni, miután hővel elpusztított virulens törzseknek tették ki.
Griffith úgy gondolta, hogy a hővel elpusztított törzsből származó "átalakító elv" felelős azért, hogy az ártalmatlan törzs virulenssé vált. 1944-ben Oswald Avery, Colin MacLeod és Maclyn McCarty azonosította ezt az átalakító elvet, amely genetikai eredetű. DNS-t izoláltak a S. pneumoniae virulens törzséből, és csak ezt a DNS-t felhasználva képesek voltak egy ártalmatlan törzset virulenssé tenni. A DNS baktériumok általi felvételét és beépítését "transzformációnak" nevezték el. Lásd az Avery-MacLeod-McCarty kísérletet.
E kísérletek eredményeit a tudományos közösség eleinte szkeptikusan fogadta. Avery kísérleteit csak akkor fogadták el, amikor Joshua Lederberg felfedezte a genetikai átvitel más módszereit (1947-ben a konjugációt, 1953-ban pedig a transzdukciót). A transzformáció csak 1972-ben vált rutineljárássá a laboratóriumokban, amikor Cohen sikeresen transzformálta az Escherichia coli baktériumot kalcium-kloriddal történő kezelésével. Ez hatékony és kényelmes eljárást teremtett a baktériumok transzformálására, és megnyitotta az utat a biotechnológia és a kutatás előtt.
Az állati és növényi sejtek transzformációját is vizsgálták, az első transzgenikus egeret úgy hozták létre, hogy 1982-ben egy patkány növekedési hormon génjét befecskendezték egy egér embrióba.
1907-ben felfedeztek egy baktériumot, az Agrobacterium tumefaciens-t, amely növényi daganatokat okozott, és az 1970-es évek elején kiderült, hogy a daganatot előidéző anyag egy Ti plazmid nevű DNS-plazmid. A kutatók a plazmidból a daganatot okozó gének eltávolításával és új gének hozzáadásával képesek voltak megfertőzni a növényeket A. tumefacienssel, és hagyták, hogy a baktérium a kiválasztott DNS-t beillessze a növények genomjába.
Nem minden növényi sejt fogékony az A. tumefaciens fertőzésre, ezért más módszereket fejlesztettek ki, beleértve az elektroporációt és a mikroinjekciót. A részecskebombázást John Sanford 1990-es találmánya, a Biolistic Particle Delivery System (génágyú) tette lehetővé.
Kérdések és válaszok
K: Mi a transzformáció a molekuláris biológiában?
V: A transzformáció egy sejt genetikai megváltoztatásának folyamata a DNS közvetlen felvétele és kifejeződése révén a környezetéből.
K: Melyik baktériumfajban fordul elő transzformáció a természetben?
V: A transzformáció néhány baktériumfajban természetes módon is előfordul.
K: Milyen kifejezéssel illetik azokat a baktériumokat, amelyek képesek átalakulni?
V: A transzformációra képes baktériumokat kompetensnek nevezzük.
K: Mi az a másik két eljárás, amellyel a transzformáción kívül külső genetikai anyagot is be lehet juttatni a baktériumsejtekbe?
V: A másik két folyamat, amellyel külső genetikai anyagot juttathatunk a baktériumsejtekbe, a konjugáció és a transzdukció.
K: Lehet-e mesterségesen transzformációt végezni?
V: Igen, a transzformáció mesterségesen is elvégezhető.
K: Mi a transzfekció definíciója?
V: A transzfekció az új genetikai anyag nem bakteriális sejtekbe, például állati és növényi sejtekbe történő bejuttatásának folyamata.
K: Miben különbözik a transzdukció a transzformációtól?
V: A transzdukció során idegen DNS-t juttatunk be egy bakteriofág segítségével a gazdaszervezetbe, míg a transzformáció során a DNS-t közvetlenül a környezetből vesszük fel és fejezzük ki.
Keres