ELISA — enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat: definíció és működés

ELISA — enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat: egyszerű definíció és működés, antitestes antigén- és citokin-detekció, gyakorlati alkalmazások és érzékenység.

Az ELISA-módszer (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) a biokémiában alkalmazott technika annak meghatározására, hogy egy bizonyos anyag - például egy specifikus citokin vagy antigén - jelen van-e egy mintában. Néha "EIA" rövidítéssel használják.

Ez a technika speciális antitesteket használ, amelyek az anyaghoz kapcsolódnak. Ezek az antitestek egy adott színt hoznak létre. A szín mennyisége jelzi a jelen lévő anyag mennyiségét. (Néha az anyagot ultraibolya fényben kell vizsgálni ahhoz, hogy az antitestek ezt a színt létrehozzák).

Egy másik antitestkészletet használnak az anyag "befogására". Ezek az antitestek mind az anyaghoz, mind a vizsgálati tartályhoz tapadnak, így az anyagot a helyén tartják.

Az ELISA-technikából egy kifinomultabb és érzékenyebb technikát, az ELISPOT-módszert vezették le.

Rövid összefoglaló a működésről

Az ELISA alapelve, hogy egy specifikus biológiai kölcsönhatást (pl. antitest–antigén) egy enzim jelzi, amely szubsztrát hatására mérhető (általában színváltozással). A jel erőssége arányos lehet a vizsgált anyag mennyiségével, ezért a módszer kvantitatív vagy félig kvantitatív mérésre alkalmas.

Általános lépések

• Bevonás (coating): a mikrotiter lemez egyes helyeire (járomokba) rögzítik az elfogó antitestet vagy antigenet.
• Blokkolás: a nem specifikus kötőhelyeket fehérjékkel (pl. BSA, tejpor) blokkolják, hogy csökkentsék a háttérjelet.
• Minta inkubáció: a vizsgálandó mintát hozzáadják; ha jelen van a célmolekula, az megkötődik.
• Detektáló antitest: egy második, jelölt (enzimmel konjugált vagy azzal laterálisan kapcsolható) antitestet adnak hozzá, amely specifikusan a célmolekulához kötődik.
• Szubsztrát hozzáadása: az enzim a hozzáadott szubsztrátot átalakítja, ami színváltozáshoz vagy fluoreszcenciához vezet.
• Mérés: a kialakuló jelet spektrofotométerrel (optikai denzitás), vagy fluoreszcencia- / lumineszcencia-mérővel mérik.

Fő ELISA-típusok

• Közvetlen (direct) ELISA: a célantigénhez közvetlenül enzimhez kötött antitest kapcsolódik. Gyors, kevesebb lépés, de kevésbé érzékeny.
• Közvetett (indirect) ELISA: elsőként egy elsődleges antitest kötődik az antigénhez, majd egy enzim-konjugált másodlagos antitest is kapcsolódik az elsődlegeshez. Több jel erősítés, nagyobb érzékenység.
• Sandwich ELISA: egy „befogó” antitest megtartja az antigént, majd egy második, jelt adó antitest kötődik hozzá. Különösen jó nagy molekulák és komplex minták mérésére, magas specificitású és érzékeny.
• Versengő (competitive) ELISA: a minta antigénje versenyez egy jelölt antigénnel a korlátozott számú kötőhelyért. Alkalmas kis molekulák (például hormonok, gyógyszermaradványok) mérésére.

Szokásos enzimek és szubsztrátok

• Hidrogén-peroxid-peroxidáz (HRP): gyakori, gyors reakció; szubsztrátok: TMB, OPD — színváltozás és mérés 450 nm körül.
• Alkalikus foszfatáz (AP): stabil, más típusú szubsztrátokkal (pl. pNPP) használják; mérés 405 nm körül.
• Fluoreszcens és lumineszcens jelölők: nagyobb érzékenységet és széles dinamikatartományt adhatnak.

Mire használják az ELISA-t?

• Diagnosztika: fertőző betegségek szerológiai vizsgálata (antitestek vagy antigének kimutatása).
• Kutatás: citokinek, növekedési faktorok, hormonok mennyiségi mérése.
• Gyógyszer- és vakcinafejlesztés: immunválasz mérése, antitestszintek követése.
• Élelmiszerbiztonság és környezetanalitika: allergének, toxinok, maradványok kimutatása.

Előnyök és korlátok

• Előnyök: egyszerű, viszonylag olcsó, nagy throughput (több minta párhuzamos vizsgálata), kvantifikációra alkalmas.
• Korlátok: keresztreakciók (specificitási problémák), mátrixhatások a komplex mintákban, „hook effect” magas koncentrációknál (hamisan alacsony jel), valamint szükség van jó minőségű antitestekre és megfelelő standardokra.

Minőségellenőrzés és kvantifikáció

A pontos méréshez szükségesek kalibráló görbék (standard curve) ismert koncentrációjú standardokkal, belső kontrollok és negatív kontrollok. A minták hígítása gyakran szükséges a méréstartományba hozáshoz. Megfelelő inkubációs idők, hőmérséklet és mosási lépések kritikusak a reprodukálhatóságért.

Kapcsolat az ELISPOT-tal

Az ELISPOT (enzyme-linked immunospot) az ELISA elvén alapul, de nem oldatos jelet ad, hanem azt méri, hogy hány sejtszintű „folt” vagy pont keletkezik egy membránon, amikor egy sejt specifikus molekulát (pl. citokint) választ ki. Így az ELISPOT egyszerre érzékeny és képes egyedi sejtek aktivitásának megjelenítésére — ezért használják immunológiai vizsgálatoknál, például T-sejtek funkciójának mérésére.

Összességében az ELISA jól bevált, sokoldalú módszer a biokémiai és orvosi vizsgálatokban, de a megbízhatósághoz gondos protokoll- és kontrollhasználat szükséges.

Kérdések és válaszok

K: Mi az az ELISA?

K: Hogyan működik az ELISA?

K: Milyen anyagokat tud az ELISA kimutatni?

K: Mit jelez az ELISA által generált szín mennyisége?

K: Az ELISA az egyetlen technika, amelyet a mintában lévő specifikus anyagok kimutatására használnak?

K: Mi a szerepe az ELISA során használt második antitestkészletnek?

K: Az ELISA mindig színt hoz létre, amikor egy anyagot észlel?

Keresés betűvel